Expérience sur l'extraction de l'ADN plasmidique

Principes généraux : 

C’est une technique de séparation biochimique par précipitations différentielles et séparation des 2 phases obtenues liquide / solide par centrifugation. 
Protocole : 
Récupération et lavage des cellules : 

Prélever 1.5 ml de suspension bactérienne ; placer en microtubes stériles

Centrifuger à 12 000 g pendant 3 minutes

Eliminer le surnageant

Ajouter 1.5 ml de suspension bactérienne

Centrifuger à 12 000 g pendant 3 minutes

Eliminer le surnageant

Remettre le culot en suspension dans 150 ml de tampon Tris-HCl 25 mM  pH 8 ; EDTA 10 mM

 

Lyse des cellules : 

Ajouter 300 ml de soude 0.2 M, SDS 1% préparés extemporanément ; Laisser agir 5 minutes au plus.

 

Purification de l’ADN plasmidique : 

Ajouter 225 ml d’acétate de sodium3 M, pH 5.2  pour réaliser la précipitation de l’ADN chromosomique dénaturé par la soude et des protéines complexées par le SDS (détergent)

Mélanger par retournements successifs 6 à 10 X

Placer les tubes dans la glace pendant 10 minutes

Centrifuger 10 minutes à 12 000 g à température ambiante

Récupérer le surnageant : volume v

Ajouter 2v d’éthanol absolu à –20°C et placer à –20°C pendant 30 minutes pour précipiter l’ADN plasmidique

Centrifuger 15 minutes à 12 000 g et à 4°C

Eliminer le surnageant

Remettre le culot en suspension dans 300 ml d’éthanol à 75%

Centrifuger 15 minutes à 12 000 g et à 4°C

Eliminer le surnageant

Sécher le culot quelques minutes à 37°Cpour éliminer l’éthanol

Remettre le culot en suspension dans 50 ml d’ED stérile
 


Cette expérience est tirée du site :  

http://209.85.129.104/search?q=cache:jz24WBm1Ous
J:pedagogie.ac-limoges.fr/svt/accueil/html/tp-spe-limosin/TP
_manip_elem_bio_mol_tech.doc+plasmidique&hl=fr&ct=clnk&cd=3&gl=fr&client=firefox-a


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